Utvidet genotyping av gravide, blodgivere og pasienter

Prøvemateriale og rekvisisjon:

• Minimum 3 ml EDTA-blod
• Uåpnet glass foretrekkes, men ved mangel av dette aksepteres åpnet glass

• Bruk rekvisisjon rekvisisjon seksjon for immunhematologi fra andre blodbanker, kryss av på genotyping og oppgi kliniske opplysninger.

Forventet svartid ca. 7-14 dager.

NB! Oppgi kliniske opplysninger som vil hjelpe oss med riktig prioritering.

Det finnes 346 kjente blodtypeantigener, 322 av disse er fordelt på 36 blodtypesystemer. Det er ikke mulig å finne allogent blod som vil være fullstendig forlikelig på alle disse antigenene. Alle pasienter skal, i henhold til dagens krav, transfunderes med ABO og RhD forlikelig blod. I tillegg skal kvinner i fertil alder (<50 år) få K negativt blod når de selv er K negative. 
 
Det molekylære grunnlaget for de fleste blodtypeantigenene er kjent, noe som gjør RBC-genotyping mulig. I mange blodtypesystemer er forskjellen mellom antigenene forårsaket av én enkelt forandring i DNA-sekvensen i blodtypegenet, en såkalt singel nukleotid polymorfisme (SNP). Derfor er det som regel enkelt å predikere fenotypen fra genotypen. Enkelte andre blodtypesystemer er derimot mer komplisert, slik som ABO-, H-, I-, GLOB-, Rh- og MNS-systemer. I ABO, H, I og GLOB er ikke antigenet det primære genproduktet, det er derfor en indirekte sammenheng mellom genotype og fenotype. I Rh- og MNS-systemet er det homologe gener, som gjør at det kan skje utveksling av DNA-sekvenser mellom genene, og dermed dannes variantgener og nye antigener. I tillegg finnes det mutasjoner som fører til at et antigen ikke alltid uttrykkes, det gir ekstra utfordringer når fenotype skal predikeres fra genotype.

Tidligere har genotyping primært blitt utført i enkelte pasientprøver som ledd i utredning ved tilfeller med uklar og ikke-konklusiv serologi. Nye teknikker for genotyping, såkalt high-throughput genotyping, har åpnet opp for muligheten til å gjøre blodtyping på en rask og standardisert måte. Dette har ført til at man i dag kan gjøre en utvidet typing av blodgiverkorpset, noe som bidrar arbeidet med å finne typelikt blod til pasienter hvor dette er indisert.

Nye blodtypeantigener, nye systemer og ny nomenklatur; Bioingeniøren 3, 2014, side 22-26.

Genteknologien inntar blodbankene; Bioingeniøren 4, 2014, side 14-16.

 
Det finnes flere kommersielle systemer for high-throughput genotyping. Avdelingen bruker ID Core XT  fra Progenika/Grifols og ulike FluoGene-kit fra inno-train.

ID Core XT er basert på xMAP teknologi og kombinerer PCR og analyse på Luminex. Det er mulig å analysere 47 prøver parallelt med bestemmelse av 29 SNPer og 37 antigener i hver prøve.

FluoGene kombinerer SSP-PCR og endepunkt fluorescence detection og avleses på FluoVista. Følgende kit brukes i utredningene:

• RBC-FluoGene ABO basic
• RBC-FluoGene vERYfy
• RBC-FluoGene Rare
• RBC-FluoGene CDE
• RBC-FluoGene D weak/variant
• HPA-FluoGene NX

Ca. en prosent av den europeiske befolkningen har en variant D egenskap som er et samlebegrep for svak og partiell D. Individer med svak D type 1, 2, 3 og 4 utgjør ca. 80-95 % av alle de med variant D egenskap, og disse er ikke i risiko for å danne alloanti-D.  Individer/pasienter med disse D-egenskapene vil derfor ikke trenge profylakse med anti-D immunglobulin i svangerskap med et RhD positivt foster eller etter fødsel (post-partum), heller ikke ved transfusjon av RhD positive trombocytter.

Pasienter med svak D type 1, 2 og 3 kan få RhD positive erytrocyttkonsentrater, dermed kan verdifullt RhD negativt blod spares til de pasientene som virkelig trenger det. Kun 15% av befolkninger er RhD negativ, dermed er denne blodtypen en begrenset resurs. I og med at man primært ønsker å fastslå svak D type 1, 2 og 3 eller fravær av disse, har vi kalt utredningen «svak D-utredning», men det vi gjør er egentlig en «variant D-utredning».

Grupper hvor variant D-utredning ved genotyping er indisert: 

1. Gravide med svak reaksjon ved serologisk RhD-typing  
ABO og RhD-typing samt antistoffscreening utføres rutinemessig i første prøve i svangerskap. Viser RhD-typing svak reaksjon (≤ 2+), sendes prøven til svak D-utredning ved Nasjonal kompetansetjeneste for blodtypeserologi, FoU, Ullevål, OUS for å identifisere gravide med svak D type 1, 2 eller 3.

Dersom svak D type 1, type 2 og type 3 ikke påvises, vil dette tolkes dithen at den gravide har en annen variant D. Gravide med en annen variant D skal følges opp i henhold til gjeldende rutine for RhD negative (jmf. algoritmene ved foster RHD-typing); med ny antistoffscreening i svangerskapsuke 24 og RhD-profylakse i svangerskapsuke 28. Foster RHD-typing vil i disse tilfellene ikke være hensiktsmessig i og med at morens RHD-gen vil maskere amplifisering av et evt. RhD positivt foster og resultatet vil være inkonklusivt.

NB! Husk at foster RHD-genotyping vil være inkonklusiv dersom en helt vanlig RhD positiv prøve analyseres, fordi morens RHD-gen vil amplifiseres omtrent samtidig med kontrollgenet. Slike prøver skal ikke sendes til foster RHD-genotyping i og med at det vil kunne føre til at en RhD positiv gravid får anbefalt og administreres anti-D immunglobulin (profylakse). Nasjonal kompetansetjeneste for blodtypeserologi, FoU forutsetter at prøver som sendes til foster RHD-genotyping fra andre blodbanker er serologisk RhD negative.

2. RhD negative gravide hvor foster RHD-typing gir inkonklusivt resultat:
Gravide med en RhD-variant som ikke oppdages serologisk, dvs. de types til RhD negativ, mens foster RHD-typing i svangerskapsuke 24 blir inkonklusiv: Denne gruppen av gravide er serologisk RhD negative på grunn av et RHD-gen som ikke uttrykkes eller uttrykkes svakt på overflaten til erytrocyttene. Morens RHD-gen vil i disse tilfellene amplifiseres i PCR-reaksjonen og vil maskere for en evt. foster RHD-positiv reaksjon. Analysen blir derfor inkonklusiv. Ved inkonklusivt resultat på foster RHD-typingen utført ved Helse Nord, -Midt og -Vest, sendes prøven videre til OUS for svak D-utredning.

3. Jenter og kvinnelige pasienter i fertil alder med svak reaksjon ved serologisk RhD-typing:
Jenter og kvinner i fertil alder (<50 år) med svak reaksjon (≤ 2+) ved serologisk RhD-typing utredes med tanke på svak D type 1, type 2 eller type 3. Ved eventuelt transfusjonsbehov eller svangerskap vil da pasienten/kvinnen få RhD positive blodkomponenter og vil slippe RhD-profylakse dersom svak D type 1, type 2 eller type 3 påvises.

4. Kvinnelige blodgivere i fertil alder med svak reaksjon ved serologisk RhD-typing:
Kvinnelige blodgivere i fertil alder (<50 år) med svak reaksjon (≤ 2+) ved serologisk RhD-typing, når DVI ikke påvises, vil svak D-utredning avklare om blodgiveren er svak D type 1, type 2 eller type 3.  De med svak D type 1, type 2 eller type 3 kan betraktes som RhD positive som gravid eller pasient ved eventuelt transfusjonsbehov. De vil da kunne spares for RhD-profylakse prenatalt, post-partum, og i forbindelse med transfusjon av RhD positivt trombocyttkonsentrat.

Prøvemateriale:
Minimum 3 mL EDTA-blod. Ønskelig med ferskest mulig prøvemateriale. Uåpnet prøveglass foretrekkes, men ved mangel av dette kan også åpnet glass aksepteres.

Fyll ut rekvisisjonen rekvisisjon for immunhematologisk utredning:

• Kryss av for genotyping, og spesifiser at det gjelder svak RhD-utredning
• Husk å legge ved utskrift av serologisk RhD-typing.

Svartid; ca. 4 uker fra vi mottar prøven. Ved inkonklusiv foster RHD-typing bør RhD-profylaksen gis i svangerskapsuke 28, dersom resultatet av svak D-utredning ikke foreligger tidsnok.

Generelt

D-antigenet inneholder over 30 epitoper. Varianter oppstår når disse epitopene er svakt uttrykt (Svak D) eller når noen epitoper mangler (partiell D). Selv om begrepene svak og partiell D defineres som foreldet og ikke anbefales å brukes lenger, har disse en viss praktisk verdi, men skillelinjene er ikke eksakte lenger. Man trodde tidligere at svak D'er ikke kunne danne alloanti-D fordi de har alle epitopene, men det er vist at så ikke er tilfelle. Samlebegrepet variant D er anbefalt å bruke nå. Det er viktig å utrede svake reaksjoner (≤ 2+) for å kunne gi persontilpasset oppfølging hos gravide og til jenter samt kvinnelige pasienter i fertil alder i forbindelse med transfusjon.

Svak D: Alle epitopene er til stedet, men de er svakt uttrykt. Den typiske årsaken er en enkel aminosyreendring i den transmembrane eller intracellulære regionen av RhD-proteinet. Dette påvirker/ reduserer uttrykket av RhD i erytrocyttmembranen. Tidligere var det tenkt at de svake D'ene ikke kunne danne alloanti-D i og med at alle epitopene er til stedet, men senere ble det vist at en del/flere svake D'er (f.eks. svak D type 4, 11, 15, 21 og 57) har dannet og kan danne alloanti-D. Undergruppene til svak 4 er under overvåkning og det er ennå ikke konsensus om håndtering av disse, derfor inntil videre anbefaler vi at de behandles/betraktes som RhD negative.  

Partiell D: Partielle D'er mangler én eller flere D-epitoper og kan reagere vanlig eller svakere med anti-D reagens. Reaksjonsstyrken for en og samme prøve kan variere med forskjellige reagenser f.eks. 1+ med et reagens og 3+ med et annet. Enkelte partielle D'er oppstår pga. såkalt hybridprotein hvor enkelte eksoner i RHD-genet er erstattet med RHCE-genets eksoner. 

Referanser:

Blood Group Antigen Facts Book, Reid ME, Lomas-Francis C, Olsson ML, Third Edition 2012

Geoff Daniels, Variants of RhD--current testing and clinical consequences - PubMed (nih.gov) British Journal of Haematology 2013

Virk M & Sandler SG, Rh Immunoprophylaxis for Women With a Serologic Weak D Phenotype - PubMed (nih.gov), Lab Med 2015